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学习记忆及认知功能

大小鼠行为学实验 | 水迷宫实验方法

实验简介

Morri s水迷宫(Morri s Water Maze, MWM)是用于啮齿类动物空间学习的检测范式,由Richard Morri s于1981年提出,其原理基于动物逃离水环境这一动机,而逃离水环境这一动机基本不受动物活动能力、体重差异的影响,因此适用于多种实验动物模型。该范式的学习阶段,逃生平台隐藏于水面之下,水池中的水由钛白粉或无毒颜色染料染成不透明液体,动物无法通过视觉或嗅觉直接定位逃生平台,必须利用远端线索进行学习,记住逃生平台的位置,形成空间参考记忆。在测试阶段,逃生平台被移除,由于学习阶段的习得,动物依旧会频繁前往原平台所在位置,因此可依据动物对原平台位置的偏好程度评定其参考记忆水平。

 

实验设置

1. 水池:不锈钢圆池,内壁不反光,平均划分为4个象限;大鼠水池直径150 cm,高60 cm;小鼠水池直径120 cm,高40 cm。

2. 平台:通常为亚克力或PVC圆形平台,大鼠平台直径12 cm,高度在20-35 cm之间,小鼠平台直径8 cm,高度在20-35 cm之间。

3. 线索:迷宫应放置在具有充足视觉线索的房间中,这些远端线索可以是特意设置的,也可以是房间内生的,关键在于因为这些是动物定位目标的导航参考点,因此测试期间禁止移动这些线索。

4. 实验者:实验者的位置可以通过几种方式处理:(a)在测试期间离开房间;(b)站在视觉屏障后面;(c)保持在恒定位置静止(注意实验者会成为远端线索之一,并且在等待动物完成任务期间,若实验者随意走动,会干扰、混淆实验结果)。


lh1102-morris-water-maze.png

 

核心原理

以 “水中应激 - 平台安全” 的趋避冲突为动机,驱动动物依赖外部环境线索建立空间参考记忆,通过观察动物寻找平台的效率(学习)和对原平台位置的搜索偏好(记忆),评估其空间学习与记忆能力。


实验流程

(一)实验前准备

1. 操作适应:测试前3天每日抓握2 min,并完成一次“饲养笼—转运笼—测试室”的往返。

2. 设备调试:核对注水高度、平台没水深度、水温实测值、摄像视野与四个远端线索。

3. 环境适应:测试前30 min将动物连同饲养笼移入测试室,静置后开始。

(二)正式实验

1. 线索学习

线索学习是莫里斯水迷宫中常用的对照范式,用于检测动物学习游向线索目标的能力。该阶段平台要么高出水面,要么保持浸没状态,但上方加装一根高出水面约12 cm的标识旗,迷宫四周的遮光帘闭合,阻断动物依靠远端环境线索进行空间导航,同时每一试次都会更换目标平台与入水起点的位置(Table 1)。如此一来,动物无法依靠远端地标完成任务,唯一能稳定指示平台相对入水点位置的就是平台上附带的标识旗。

如果动物在线索学习任务中表现受损,那么研究人员就要意识到观测到的缺陷未必是空间记忆缺陷。线索学习和空间习得任务依赖相同的基础能力(完好的视觉、游泳运动能力、基础行为策略:学会离开池壁、学会爬上平台),以及相同的动机(逃离水环境),因此,如果动物无法完成线索任务,那么它在空间任务中依靠远端线索学习的能力就不可信。

线索学习可以安排在空间习得任务之前或之后开展,放在前面更优。此外,部分动物找到平台后,会再次跳回水中继续搜寻,推测是它还在尝试寻找其他逃生路径。在最初的几个试次里,动物入水后应激兴奋,即便找到了平台,也不一定明白平台就是逃生出口。因此先进行线索学习任务,能避免在动物尚未掌握上述基础技能时即进行空间习得任务。

Table 1 Acued learning trial pattern.

Morris水迷宫-表1-拉夫海思.jpg 

2. 空间习得

a. 平台没入水面下1–2 cm,用于小鼠时该深度常减至0.5–1 cm。

b. 将动物面朝池壁放置在迷宫预设入水起点(Table 2),在水面释放动物(禁止从高处丢下),动物入水的同时启动视频追踪程序。

c. 动物抵达平台时停止视频追踪程序。小鼠单试次时限为60 s或90 s,大鼠为120 s。若动物在时限内未能找到平台,实验人员将其放置到平台上,或引导其游至隐藏平台。

d. 试间间隔(ITI)期间,让动物停留在平台上停留30 s或60 s,不过10-15 s更为普遍,也能获得良好的学习效果。让动物停留在平台上的目的是使其感知自身空间方位,依托周边线索记住目标位置。由于小鼠更容易出现低温应激,进而影响行为表现,因此小鼠实验常采用稍长的ITI,尤其首轮测试阶段,有利于提升学习效果。

e. 将动物放到新的入水起点,重复上述测试(步骤a–d),直至完成当日预设试次数。动物一般每日进行多轮测试,最常用为每日4次,对应4个主方位起点,保证每日起点均衡。

f. 后续天数重复开展测试,直至学习曲线达到平台期(通常为5-6天)。

Table 2 Morris water maze spatial (hidden platform) start positions.

Morris水迷宫-表2-拉夫海思.jpg 

3. 记忆检测

a. 撤去隐藏平台,将动物面朝池壁放在全新入水起点(Table 2),该阶段选用全新起点是为了保证动物的象限偏好反映的是对目标位置的空间记忆,而不是记住了某一条固定游泳路线。

b. 60 s或90 s后取出动物。

要点:该阶段用于评估参考记忆,不宜紧跟在空间习得的最后试次开展,该方法检测的是近期记忆,并非长时记忆,通常在空间习得结束24 h后开展。

4. 空间反转

a. 如需开展空间反转实验,则将平台移至另一象限(通常为空间习得阶段的对角象限,Table 3),每日4个试次,连续测试5天(操作同空间习得实验步骤a–e)。

b. 反转阶段结束后,参照步骤开展反转记忆检测。

Table 3 Morris water maze spatial (hiddenplatform) start positions.

Morris水迷宫-表3-拉夫海思.jpg 

行为指标


1. 目标象限停留时间;

2. 原平台穿越次数;

3. 逃逸潜伏期;

4. 游泳路径长度;

5. 游泳速度。

 

分析实验(TOP-ATP)

(一)划分观察区与分析区

观察区为整个圆形水池,分析区包括四个扇形象限区域,以及逃逸平台区域。

Morris水迷宫-区域划分-拉夫海思.jpg 

(二)多通道同步采集

TOP-ATP可支持16通道同步采集。

Morris水迷宫-多通道-拉夫海思.jpg 

(三)数据分组

Morris水迷宫-数据分组-拉夫海思.jpg 

(四)分析参数配置

根据参数配置建议选择对应的分析参数。

Morris水迷宫-分析参数配置-拉夫海思.jpg 

(五)计算结果

点击【计算】即可获得分析参数所对应的数值,可导出为Excel格式文件。

Morris水迷宫-计算结果-拉夫海思.jpg 

(六)可视化分析

点击【绘制】即可一键生成可视化结果,输出内容包含动物轨迹图、速度热图等;支持 svg、png、ep s、tiff等多格式导出。

Morris水迷宫-可视化分析-拉夫海思.jpg 


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